lb培养基配方(TB培养基配方)

引言
原核表达系统是基因工程中最早、应用最广、效率最高的经典表达系统。常用大肠杆菌表达系统，具有培养简单、周期短、成本低、表达水平高等特点。
蛋白在大肠杆菌系统中表达的主要过程如下:
目的片段的PCR扩增-基因片段克隆入表达载体-表达宿主菌的转化-目的蛋白诱导表达的优化-目的蛋白的纯化。

解决方案
1寻找目标基因序列
因为引物是根据目标基因序列设计的，所以寻找目标基因序列是设计引物的第一步。目标基因序列可以在很多网站或文献中找到。
下面是常用的NCBI网站搜索基因序列的方法。NCBI是美国国家生物技术信息中心，其网站上有许多生物学数据库，是生物学研究的常用网站。

1.1打开NCBI网站，从下拉框中选择基因，输入目标蛋白的名称；(这里以p65为例)

1.2找到对应的物种，或者在右边的框中选择物种搜索；

1.3下一页，找到mRNA和蛋白质，选择正确的同工型，其中NMxxx代表mRNA序列，NPxxx代表蛋白质序列；

1.4下拉新页面，点击CDS，点击右侧FASTA，得到目的基因的mRNA序列。复制并粘贴到一个新的文本中使用。

2。选择合适的表达载体
常用的原核表达载体有pET15b、pET28a、pGEX4T1、pGEX-6p-1等。表达载体一般包括启动子、多克隆位点、抗性基因、标签基因等。
表达载体的选择原则:
1)启动子是否为原核启动子；
2)标签基因是否是我们需要使用的标签。
常用的标签有His、GST、MBP、Strep、Flag等。标签选项如下:

3。设计引物
设计引物的软件也有好几个。下面是常用的Primer 5软件。
引物设计的基本原则如下:
1)引物长度一般为15-30bp，常用引物长度为18-27bp，但不能大于38bp；
2)引物的GC含量一般在40%-60%，最好在45%-55%，上下游引物的GC含量和Tm值要接近；
3)引物对应的模板序列的Tm值约为72℃；
4)3 & # 39；最好不要做连续基，GGG或者CCC会导致错误启动，还有3 & # 39；末端最后一个碱基不能是A或T，否则容易导致错配；
5)用公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值，即为退火温度。选择Tm值较低的引物的退火温度作为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，并在70-75℃范围内；
6)最好用5 & # 39；稳定的终端(高GC含量)，而3 & # 39；末端不稳定(AT含量高)的引物，其结构能有效消除假引发反应；
7)底漆和产品的Tm值相差太大，最好在20℃范围内。

此外，还需要在引物两端添加限制性位点和保护碱基。为了保证基因序列的方向性，防止自身连锁，现在基本上都选择双限制性位点。限制性位点的选择原则:
1)限制性位点存在于载体上，但不存在于基因序列中；
2)两种酶最好有共同的缓冲系统；
3)载体上两种酶的限制性位点不能太近。
如果载体上没有标签序列，也需要在引物设计中添加标签序列。

如何确定限制性位点
3.1打开引物5，选择file-new -DNAsequence，输入上述保存的CDS序列，按原样点击；；

3.2点击左边的酶框，查看载体上选择的双酶切位点是否在右边的框中。如果没有，从左框加到右框；

3.3单击“确定”查看CDS序列中是否有任何选定的限制性位点。如果所选的双限制性位点存在于目标蛋白的CDS序列中，则需要重新选择双限制性位点。

如何设计引物
3.4打开Prime 5软件，点击文件—新建—DNA序列。

3.5点击空粘贴我们之前找到的目标基因的CDS序列，按原样选择。

3.6点击左上角的引物，其中S为正向引物，A为反向引物。

3.7点击编辑引物编辑序列，可以调整引物长度，添加限制性位点序列，保护碱基。如果发夹、二聚体、假启动、交叉二聚体或Tm值过高或过低，则需要调整。

如果检测到引物特异性
3.8 Primer-BLAST在NCBI首页底部找到，打开；

3.9输入上游和下游引物序列，然后单击底部。

；

3.10如果只能检测到你的目的蛋白基因，特异性好。

得到合成的引物后，我们就可以扩增目的基因了。合成基因通常基于目标物种的基因组。
由于真核生物的基因组中存在内含子序列，在mRNA的剪接过程中被切断，因此在构建真核基因克隆时，基因组DNA不能直接作为PCR扩增的模板。只能从细胞或组织中提取总RNA或mRNA，以逆转录cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因。

4。从细胞中提取总RNA
4.1从细胞培养箱中取出装满细胞的细胞培养皿，小心吸出培养基，加入4ml预冷的PBS，将细胞培养皿倾斜3次以充分洗涤细胞，然后小心吸出PBS溶液。
4.2在培养皿中加入1ml Trizol试剂裂解细胞，冰上静置5min，枪头吹气，室温静置5min；
4.3将细胞裂解液吸取至1.5ml EP管中，加入0.2 ml氯仿，用摇床摇匀15s。
4.4室温静置2-3min，12000xg离心，4℃，15min。
4.5离心后的液体分为三层(上层无色层为RNA，中层为DNA，底层为蛋白质)。小心地将上层的无色液体吸入新的EP管中。
4.6加入等体积的异丙醇，混匀，冰上静置10分钟，12000xg，4℃，离心10分钟。
4.7此时试管底部可见RNA白色沉淀，弃去上清液。
4.8加入1ml 75%乙醇，用摇床摇匀30s，7500xg，4℃，离心5min。
4.9小心除去上层清液，将管内沉淀物在超净台内吹干，静置3-5min。
4.10加入20微升DEPC水溶解。或水浴加热器55-60℃加热10-15分钟。
4.11纯度和浓度的测定。吸光度比A260/280接近2表明纯度高。

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5。获得cDNA的逆转录
逆转录通常通过使用试剂盒和PCR仪器来进行。这里参照爱必信的RT-PCR试剂盒产品说明书进行介绍。
产品组件:

实验方法:
5.1将RNA模板、引物、2×一步RT-PCR SuperMix、RT酶混合物和无RNase水溶解后置于冰上备用。
5.2配置以下反应系统:

5.3轻轻混合，短暂离心，使管壁上的溶液可以收集在管底。
5.4常见反应程序:

5.5反应完成后，测量纯度和浓度。

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6。靶基因的扩增
靶基因的扩增通常通过使用试剂盒和PCR仪器来完成。这里参考一下爱必信的2xPfu Master Mix的产品说明书。
注意:所有成分在开封前都要仔细混合离心，所有PCR操作都要在冰上进行。
操作示例:以50 μl PCR反应体系为例。
6.1根据下表准备PCR反应系统。

*模板量:RT-PCR反应后1-2μ l cDNA。
6.2 PCR反应周期的设置

6.3结果检测:取2-5 μl反应液进行电泳观察，确定纯度和浓度。

目的基因扩增后，需要将目的基因与表达载体连接。通常，用相同的两种限制酶切割靶基因和表达载体以获得互补的限制位点，然后用T4连接酶将这两部分连接在一起。目的基因扩增后，目的基因的缓冲体系可能会影响消化效果，所以通常会先对目的基因进行纯化，也叫切胶回收。

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7。目的基因的纯化
先凝胶运行，再切胶回收。胶水切割和回收通常通过使用套件进行。这里可以参考爱必信的DNA凝胶/PCR纯化试剂盒的产品说明书。
7.1取50xTAE缓冲液20ml，加水至1000ml，制成1xTAE电泳缓冲液备用。
7.2称取0.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 1xTAE电泳缓冲液，微波炉加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。在加热过程中不时摇动，使琼脂糖均匀分散在溶液中。
7.3将梳子插入制胶槽中，向冷却的琼脂糖中加入GelRED染色剂，慢慢倒入制胶槽中。将凝胶制作罐放入电泳仪中，将TAE电泳缓冲液倒入电泳仪中。
7.4向50ul PCR产物中加入10ul 6x上样缓冲液并混匀，用移液管小心地加入加样孔中。将核酸标记加入旁边的孔中。
7.5加完样品后，盖上电泳仪，启动电源。电压一般设置为100V V，当溴酚蓝指示运行到合适位置时，关闭电源停止电泳。
7.6将凝胶转移到核酸检测仪上，在紫外灯下快速准确地切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，放入1.5ml离心管中。
下面是爱必信DNA凝胶/PCR纯化试剂盒的产品说明书，介绍胶水回收。
产品组件:

7.7 DNA吸附柱平衡处理:在凝胶回收柱中加入200μl缓冲液CBS，12000rpm离心1min，将废液倒入收集管中，将凝胶回收柱放回收集管中。然后在凝胶回收柱中加入200μl ddH2O，以12000rpm离心1分钟，将废液倾倒在收集管中。将凝胶回收柱放回收集管中。
7.8从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶，估算重量或准确称重。每100毫克1%琼脂糖凝胶加入100微升结合溶液。
7.9。50-60℃水浴5-10分钟，期间每隔2-3分钟轻轻倒置搅拌均匀，直至胶块完全熔化。
7.10。50-60℃水浴5-10分钟。在此期间，每隔2-3分钟轻轻倒置并搅拌均匀，直到胶块完全熔化。
7.11将吸附柱放回收集管中，加入500μl WA溶液，以12000rpm离心1min，将废液倒入收集管中。
7.12将吸附柱放回收集管中，加入500 μ l洗涤液，以12000rpm离心1min，将废液倒入收集管中。
7.13重复上一步一次。
7.14将吸附柱放回收集管中，以12000rpm离心1分钟，打开吸附柱的盖子，在室温下放置5-10分钟或50℃放置3-5分钟，以完全去除洗涤液。
7.15将吸附柱放入干净的1.5ml收集管(试剂盒自带)，向膜中心悬浮液空中加入30-50μl洗脱缓冲液，盖好，37℃静置2min，12000rpm离心1min。离心管中的液体是含有目标基因的溶液。
7.16检查纯度和浓度。
DNA纯度为OD260/280时，1.8的比例最佳，最高纯度为1.8-2.0。

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8。目的基因和表达载体的双酶切
请参考购买的限制性内切酶说明书，常规方法在此介绍。
8.1在两个PCR试管中混合以下成分:
表达载体消化:

表达载体

2ug

10x缓冲器

5ul

酶1

1ul

酶2

1ul

ddH2O

补足到30ul。

PCR产物的酶消化:

目标碎片

43ul

10x缓冲器

5ul

酶1

1ul

酶2

1ul

8.2均匀轻弹管壁并短暂离心。
8.3放入37℃的PCR仪中3h。
8.4运行电泳以回收凝胶。

9。目的片段与表达载体的连接
9.1取PCR管，加入2ul酶切后的表达载体片段、6ul酶切后的目的基因片段、1ul T4 DNA连接酶、10* T4缓冲液1ul，轻轻混匀管壁，短暂离心。
9.2放在PCR仪中16℃过夜。

0.
在目的基因与载体的连接反应中，有许多可能的连接方法。除了正确的连接之外，还可能存在载体和载体之间的连接、靶基因和靶基因之间的连接或部分连接。因此，有必要筛选出正确连接的重组质粒。通常将连接产物转化大肠杆菌，通过菌落PCR或限制性内切酶鉴定筛选出阳性克隆，然后送到测序公司进行测序。阳性克隆的精确测序可以大量扩增和保存。
常用的大肠杆菌感受态细胞是DH5α或TOP10。
10.1取出感受态大肠杆菌，放在冰上慢慢融化。
10.2将连接产物加入100微升感受态大肠杆菌中，轻轻混合，冰上孵育30分钟。
10.3将EP管放入42℃水浴中90秒，然后迅速放在冰上2分钟。
在10.4EP管中加入400u LB培养基，置于摇床上，37℃，500rpm培养45分钟。

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DH5α感受态细胞

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11。平板涂布培养
500 rpm离心1-2分钟，留100ul培养基上清液，轻轻混合转化的大肠杆菌，涂布于含抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

12。克隆选择和阳性克隆的鉴定
挑3-5个克隆，放在不同的离心管中(如果菌落不多，可以全部选择)。此时可以进行菌落PCR和酶切鉴定。
1)菌落PCR
与质粒构建时的PCR扩增相同，使用相同的引物，用选择的菌落替换模板；如果凝胶有扩增带，则为阳性克隆；
2)通过酶消化鉴定
菌落质粒，以及在质粒构建过程中使用该酶进行酶消化；如果看到目的片段，凝胶为阳性克隆；

13.质粒提取
酶切鉴定需要提取质粒。如果是直接送到公司测序，这一步也可以省略。通常，质粒提取也通过使用试剂盒进行。这里参照爱必信质粒小量快速提取试剂盒的产品说明书进行介绍。
产品组件:

实验方法:
13.1向吸附柱AC中加入500μl平衡溶液BL(吸附柱置于收集管中)，以12,000rpm离心1min，将废液倾倒在收集管中，将吸附柱放回收集管中。
13.2取1.5-4.5ml过夜培养液，以12,000rpm离心30秒，尽可能多地排出上清液，收集细菌。
13.3用250μl P1溶液重新悬浮细菌沉淀，并涡旋至完全悬浮。
13.4加入250μl溶液P2，轻轻上下翻动4 -7次(裂解时间不超过5min)，使细菌充分裂解。
13.5加入350μl P3溶液，立即轻轻上下翻动4 -7次，并充分混合。此时会出现白色絮状沉淀，以12,000rpm离心5 min。
13.6将上清液加入过滤柱E(过滤柱置于1.5ml或2ml离心管中)，以12,000rpm离心2分钟，收集液体。如果上清液较大，请离心两次。
13.7将上述液体转移到吸附柱AC中(吸附柱置于收集管中)，以12,000rpm离心30-60秒，将废液倾倒在管中。可选步骤:当使用的菌株为endA菌株如JM系列和HB101或野生型菌株时，由于核酸酶含量丰富，应加入500μl去蛋白溶液PD，以12,000rpm离心30-60秒，废弃废液。
13.8加入500μl冲洗液WB(请先检查是否加入了无水乙醇！)，以12000转/分的速度离心30-60秒，弃去废液。
13.9重复上一步。
13.10将吸附柱AC放回空收集管中，以12,000rpm离心2分钟，并将吸附柱置于室温下数分钟，以彻底干燥吸附材料中残留的漂洗液，从而防止漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
13.11取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，在室温下放置几分钟。
13.12在吸附膜中部加入50μl-100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液预先在65-70℃水浴中加热，效果更佳)，室温放置2 min，12,000rpm离心1 min。如果需要大量质粒，可将所得溶液再次加入离心吸附柱，离心1分钟。(注:如果用ddH2O作洗脱剂，其pH值应在7.0-8.5范围内。如果pH值低于7.0，洗脱效率会降低。洗脱缓冲液的体积不应小于50 μl，过小的体积会影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃以防止DNA降解。)[br/]14。测序
对鉴定出的阳性克隆进行培养，送公司测序。成功测序的菌株被培养和保存。

15。目的蛋白的表达大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞通常用于目的蛋白的表达。培养成功鉴定的克隆后，提取重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。对于质粒的提取和转化，请参考前面的步骤。
将含有重组质粒的15.1大肠杆菌菌株BL21(DE3)接种到含有抗生素的5ml LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜。将过夜培养基接种到含抗生素的500ml LB培养基中，培养至o d600 = 0.4–0.6。
加入15.2 IPTG诱导目的蛋白的表达。可以探索IPTG的浓度和时间。IPTG的摸索浓度为0.05-1.0毫米，诱导时间为1-5小时。
通过离心(16，000g，3分钟)收集15.3大肠杆菌细胞，并用裂解物(100μl 50mm Tris–HCl缓冲液，pH 8.0，含有200 mm NaCl、2% triton x-100和3mm蛋白酶抑制剂pmsf)悬浮细胞沉淀，然后在每次脉冲之间以7s间隔超声处理d3s。
15.4超声(4℃16000g，15min)后离心细菌，取部分上清液与6xloading缓冲液混合，95℃加热5min。SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色，检测蛋白表达是否成功。

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IPTG

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IPTG蛋白表达诱导

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考马斯亮蓝染色试剂盒(普通型)R250

100毫升

SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶染色

16。蛋白质纯化
可以纯化成功表达目的蛋白质的菌液的上清液。蛋白质纯化通常采用两步或三步纯化法。

16.1标签亲和层析
根据您构建质粒时选择的标签，选择相应的标签亲和层析产品。常用的标签有HIS、GST、MBP、Strep、FLAG等。这里以His标签预装柱和重力柱为例进行介绍。
(一)HisTrap HP预填充柱的使用说明
结合缓冲液:20mM磷酸钠缓冲液、0.5M氯化钠、20-40mM咪唑、PH7.4
洗脱缓冲液:20mM磷酸钠缓冲液、0.5M氯化钠、500mM咪唑、ph 7.4
[1 .在系统中设置低流速，取下预装色谱柱顶部的塞子，将色谱柱连接到ӓkta净化器的连接器上。注意液滴的连接，防止气泡的引入。
2。拔下色谱柱底部的插头，将其连接到净化器。
3。用3-5倍柱体积的蒸馏水冲洗掉乙醇。
4。用5倍柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。建议流速为1毫升/分钟(1毫升柱)和5毫升/分钟(5毫升柱)。
5。使用加样环或超级环添加预处理的样品(样品必须在加样前进行离心和过滤)。上样时，建议流速为0.2-1毫升/分钟(1毫升柱)，0.5-5毫升/分钟(5毫升柱)。
6。用结合缓冲液清洗至少10至15倍柱体积，直到吸收峰达到稳定基线或流出液中无物质流出。建议在冲洗过程中保持流速在1-2ml/min(1ml柱)和5-10ml/min(5ml柱)。
7。用洗脱缓冲液进行一步洗脱或线性梯度洗脱(来咪唑浓度梯度)。一步洗脱通常有5个柱体积，线性洗脱通常有10-20个柱体积。在洗脱过程中保持1-2ml/min(1ml柱)和5-10ml/min(5ml柱)的流速。
8。洗脱后，用3-5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子，然后加入20%乙醇。拧紧柱子上方和下方的塞子，防止它们变干。
注:如果需要从净化后的样品中去除咪唑，建议使用HiTrap脱盐脱盐柱或PD-10脱油柱。

(二)Ni Sepharose 6 FF重力柱的使用说明
结合缓冲液:20mM磷酸钠缓冲液、0.5M氯化钠、20-40mM咪唑、PH7.4
洗脱缓冲液:20mM磷酸钠缓冲液、0.5M氯化钠、500mM咪唑、PH7.4
上样前需过滤。
1。准备PD-10 空色谱柱
1。用20%乙醇清洗滤膜。
2。用蒸馏水冲洗滤膜。
3。将滤膜放入PD-10 空柱中。
二。填料的制备1。轻轻摇动瓶子，直到填料悬浮液均匀。
2。将所需量的填充悬浮液从瓶中转移到离心管中。
3。用500xg离心5min，沉淀填料。
4。除去上清液，加入适量蒸馏水。
5。轻轻摇动包装悬浮液3分钟，然后用500xg离心5分钟。
6。除去上清液，加入适量的结合缓冲液，重复步骤5。
7。将填料悬浮液转移到量筒中。
8。加入适量的结合缓冲液，使悬浮液中的填料浓度达到50%。
三。通过重力柱纯化。将样品添加到含有50%填料的悬浮液中(样品在进入色谱柱前应进行离心和过滤)。镍琼脂糖凝胶6FF的平均负载量为40毫克/毫升。1毫升50%悬浮液的负荷量约为20毫克蛋白质。
2。在摇床上低速混合样品和填料混合物1小时。
3。将样品和填充剂混合物添加到PD-10的空柱中，并收集流出液。
4。用结合缓冲液冲洗2-5倍柱体积，并收集流出液。
5。用4倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集流出液。

16.2离子交换
离子交换需要根据你蛋白质的等电点选择阴离子交换柱或阳离子交换柱。
1。如果你的蛋白质的等电点小于缓冲液的PH，选择阴离子交换柱(Q，DEAE)；
2。如果你的蛋白质的等电点大于缓冲液的PH值，选择阳离子交换柱(S，SP，cm)；
这里以Q柱为例。

结合缓冲液:缓冲液的PH值比目标蛋白的等电点高一个PH值。
推荐的缓冲区:

洗脱缓冲液:结合缓冲液+1M NaCl
样品需要过滤并在装载前替换到结合缓冲液中。缓冲液需要预过滤和超声波去除气泡。

1.在系统中设置低流速，取下预装色谱柱顶部的塞子，将色谱柱连接到ӓkta净化器的连接器上。注意液滴的连接，防止气泡的引入。
2。拔下色谱柱底部的插头，将其连接到净化器。
3。用3-5倍柱体积的蒸馏水冲洗掉乙醇。
4。用5倍柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。建议流速为1毫升/分钟(1毫升柱)和5毫升/分钟(5毫升柱)。
5。使用加样环或超级环添加预处理的样品(样品必须在加样前进行离心和过滤)。加载时，建议流速为1ml/min(1ml体积栏)和5ml/min(5ml体积栏)。
6。用结合缓冲液冲洗至少5倍柱体积，直到吸收峰达到稳定基线或流出液中无物质流出。建议冲洗时保持1ml/min(1ml柱)和5ml/min(5ml柱)的流速。
7。使用洗脱缓冲液进行一步洗脱或线性梯度洗脱(拉NaCl梯度)。一步洗脱通常需要5-10个柱体积，线性洗脱通常需要10-20个柱体积。在洗脱过程中，流速保持在1毫升/分钟(1毫升柱)和5毫升/分钟(5毫升柱)。
8。洗脱后，使用5倍柱体积的结合缓冲液+1M NaCl进行再生，然后用5-10倍柱体积的结合缓冲液清洗柱子，然后加入20%乙醇。拧紧柱子上方和下方的塞子，防止它们变干。

16.3凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法主要用于聚合物的精细纯化或去除。凝胶过滤层析主要根据样品量和蛋白质分子量来选择。
这里以Superdex 200涨幅10/300为例进行介绍。

缓冲液的选择:
可以根据您的样品或下游应用选择缓冲液。由于在非常低的盐浓度下，酸性和碱性蛋白质之间可能发生离子相互作用，推荐的缓冲液是0.01至0.05 M磷酸钠加上0.15 M NaCl，pH 7.4。

样品处理:
分子量:10KD-600KD
上样量:25-500ul
蛋白质浓度:样品中最大50 mg/mL，低于10 mg/mL可获得更高的分离度。
准备:将样品溶解在缓冲液中，以10 000 g离心10分钟，用0.22微米过滤器过滤。

1.根据色谱柱的耐压性，设置系统中的柱前压力和压差
2。在系统中设置低流速，取下预装色谱柱顶部的塞子，将色谱柱连接到ӓkta净化器的连接器上。
注意液滴的连接，防止引入气泡。
3。拔下色谱柱底部的插头，将其连接到净化器。
4。用至少2倍柱体积(CV)的室温去离子水以0.75 mL/min的流速进行平衡。
5。用至少2倍柱体积(CV)的缓冲液以0.75 mL/min的流速平衡色谱柱。
6。样品装载和缓冲液洗脱以0.75毫升/分钟的流速进行。
7。纯化后，用2CV去离子水清洗柱子，然后用20%乙醇填充。拧紧柱子上方和下方的塞子，防止它们变干。

17.凝胶电泳鉴定
纯化蛋白的大小和纯度可以通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
17.1点胶:取出电泳仪制胶框，清洗玻璃板，夹住玻璃板。首先，准备下分离胶。
用烧杯或锥形瓶按下式配制。

摇匀，用移液管慢慢加入到玻璃盘中，尽量注意不要产生气泡。将1毫升无水乙醇或蒸馏水压在分离胶上。分离胶凝固后，倒出上层的无水乙醇或水，用滤纸吸干。按下式配制上层浓缩胶。

摇匀，用移液管慢慢加入到玻璃盘中，尽量注意不要产生气泡。插入梳子。
17.2装载
将准备好的凝胶从制胶架上取下，放入电泳槽中。电泳槽中加入电泳缓冲液。一些样品与6x加载缓冲液混合，并在95℃加热5min。拔出胶水上的梳子，将样品放入梳子孔中。在旁边的孔中加入蛋白质标记。
电泳缓冲液配方:

17.3凝胶运行
盖上电泳仪，插上电源。可以先用80V跑胶，等样品跑进分离胶后再用220V跑胶。溴酚蓝跑到较低的位置，停止跑胶。
17.4染色
考马斯亮蓝R250可用于凝胶染色。这里介绍一下爱必信的Cumas亮蓝R250的产品说明。
(1)电泳结束后，取凝胶放入适量的考马斯亮蓝染色液中，保证染色液能完全覆盖凝胶。
(2)放在水平摇床或侧摇床上，慢慢摇动。在室温下染色1h或更长时间。
注意:具体染色时间取决于凝胶的厚度和染色温度。凝胶越厚，温度越低，染色时间越长。凝胶越薄，温度越高，染色时间越短。通常染色后的凝胶颜色与染液颜色非常接近，在染液中几乎看不到凝胶时，可以认为已经被充分染色。
(3)倒出染色液。染液至少可以循环使用2-3次。
(4)加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，保证脱色液能完全覆盖凝胶。
(5)放在水平摇床或侧摇床上，慢慢摇动。室温下脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本完全去除，蛋白带染色效果达到预期水平。通常脱色1-2小时后可出现蛋白质条带。
注意:脱色时间过长也会导致蛋白质条带颜色变浅。
(6)脱色后观察并拍照。