酵母双杂交(酵母双杂交筛选互作蛋白)

原理简介

Fields于1989年提出酵母双杂交技术，开辟了蛋白质相互作用筛选的快速通道。该技术基于对真核转录因子，尤其是酵母转录因子GAL4的性质的研究。GAL4包括两个结构域，即位于N端的DNA结合结构域(BD)和位于C端的转录激活结构域(AD)。BD可以识别GAL4反应基因的上游激活序列(UAS ),并与之结合。AD可以启动UAS下游基因的转录。BD和AD单独不能激活转录，但当它们在空中足够接近时，表现出完整的GAL4转录因子活性，并能激活UAS下游启动子，转录启动子下游基因并使其表达。

在酵母双杂交系统中，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合。如果在X和Y之间形成蛋白质-蛋白质复合物，AD和BD将在空中彼此足够接近，并且结构域将被重建以开始报道基因序列的转录。带有BD质粒的酵母可以在一种缺陷培养基上生长，而带有AD质粒的酵母可以在另一种缺陷培养基上生长。通过交配或共转化，酵母可以同时拥有AD和BD质粒。如果BD上的诱饵蛋白与AD上的目的蛋白相互作用，这样的酵母菌株就可以在三缺和四缺培养基上生长，并启动β-半乳糖苷酶基因的转录。

图 酵母双杂原理图:酵母双杂交原理

01酵母双杂交系统假阳性的原因？怎么解决？

可能的原因:

根据酵母双杂交原理，如果BD融合的诱饵蛋白具有单一的激活功能，或者其激活功能可以被外源蛋白激活，从而激活下游报告基因的表达，最终会导致假阳性。因此，在实验中，需要进行严格的对照实验，将诱饵和目的蛋白分开识别，激活报告基因，以排除假阳性。

解决方法:

(1)可以选择多个报告基因(HIS、ADE、MEL1)进行更严格的筛选，每个报告基因的上游调控区域不同，大大减少假阳性；

(2)适当增加AbA或3-AT的浓度；

(3)将报告基因整合到染色体上，可以稳定基因表达水平，消除质粒拷贝数变化引起的基因表达水平波动而引起的假阳性。

02，PCR检测到多个片段。

可能的原因:一个酵母细胞可以包含多种捕获蛋白。

解决方法:选择单克隆刮平板2-3次，筛选蓝白点至无分离，找到阳性克隆进行后续实验。

03诱饵蛋白具有自激活活性。如果它能单独激活报告基因的表达呢？

(1)加入适量的3-AT可抑制某些微弱的自激活。如果更高的3-AT不能抑制自激活，就需要截短诱饵蛋白的表达。

(2)如果蛋白质是具有转录激活域的转录因子，则需要去除转录激活域；如果不是转录因子但仍具有较强的转录激活活性，则需要去除诱饵蛋白的活性区域后再进行后续操作，但该操作可能会影响蛋白-蛋白相互作用。

(3) Co-IP技术可用于识别相互作用蛋白，不受诱饵蛋白自激活的限制。

自激活检测主要有两个作用:一是要根据饵料蛋白的自激活程度来调整AbA或3-AT的浓度；其次，检测诱饵蛋白是否有毒。如果菌落生长太慢，表达的蛋白可能是有毒的，所以需要使用低拷贝质粒来表达诱饵蛋白。

04如何选择核系统库和膜系统库？

如果诱饵蛋白位于膜上或包含跨膜结构域，则选择膜系统文库，如果诱饵蛋白位于核内，则选择核系统文库。具有跨膜结构域的诱饵蛋白也可以通过去除跨膜结构域或选择胞内结构域来筛选，但这可能会影响目标蛋白的结构和功能，存在一定的风险。

蛋白质跨膜结构可以通过使用以下网站预测:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

05膜系统酵母双杂交筛选如何选择饵料载体？

膜酵母杂交系统可以根据诱饵基因的蛋白跨膜方式选择不同的载体。确定诱饵基因的蛋白质结构后，可根据下表选择合适的载体:

这里有几个分析蛋白质结构的网站:

(1)用于分析膜蛋白的细胞内和细胞外区域的网站:

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/

(2)详细分析蛋白质的信号肽序列，以及N端是否存在cleavge位点的网址:

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

06酵母双杂交系统的筛选过程？

(1)首先分析目的蛋白的结构，确定它是膜蛋白还是有跨膜结构。如果有跨膜结构，就要根据具体的蛋白质结构选择合适的饵料载体。如果没有跨膜结构，一般使用饵料载体pGBKT7

(2)将目的基因构建成诱饵载体，然后转化酵母进行自激活检测和毒性检测，根据自激活检测结果确定合适的筛选条件；

(3)将cDNA文库质粒转化到菌株中，涂布在合适的筛选平板上，培养4-7天，从筛选平板中选出阳性克隆点平板，在四缺口平板中再次确认与诱饵蛋白相互作用的蛋白；

(4)用通用引物对筛选出的阳性酵母菌株的cDNA片段进行扩增和测序，并将该片段的编码序列在genebank中进行比对，研究其与已知基因的生物学功能关系。

07杂交效率不高怎么办？

酵母文库可以通过交配和质粒转化进行筛选。

交配是指将饵料菌液(pGBKT7-Bait/AH109)与酵母库Y187菌液混合后培养。交配效率不高，可能是因为杂交细胞数量不足。饵料菌株过夜培养时，应选择大而新鲜的克隆进行培养，饵料蛋白的液体培养量应适当增加，酵母库中工作菌液的效价应在10^8 CFU/mL以上。同时，可以延长杂交时间，直到通过显微镜检查观察到三叶草形的合子，才可以进行后续操作。

低质粒转化效率可以通过以下方法解决:

(1)检查文库质粒DNA的纯度，如果可能，考虑用乙醇重新纯化；

(2)DNA-BD/诱饵蛋白很可能有毒；

(3)配制新鲜培养基，进行对比转化；

(4)严格按照操作规程进行操作。

08 3-AT的筛选浓度如何选择？有没有建议的浓度范围？

一般情况下，HIS基因会有轻微的泄漏，导致三缺平板上无互作的克隆生长较弱。这种情况可以通过添加适量的3-AT来抑制。理想情况下，少量酵母将在10mM浓度的3-AT平板上生长，但在20mM浓度的3-AT平板上没有或几乎没有酵母生长。如果酵母在80mM 3-AT平板上仍能生长，说明饵料蛋白的自激活活性太高，不能用于双杂交筛选。

09饵料蛋白的大小影响酵母双杂交的结果吗？

虽然文献报道有8-750个氨基酸的酵母双杂交成功案例，但分子量较大的蛋白质在酵母中可能折叠错误。因此，在实际工作中，分子量较大的饵料蛋白在酵母中寻找相互作用蛋白的成功率会低于中等分子量的饵料蛋白。

筛选培养基上有太多克隆。

可能的原因:诱饵蛋白可能具有自激活性，可以激活下游筛选标记的表达；或者筛选条件太宽松。

解决方法:选择更严格的筛选条件，抑制诱饵蛋白的自激活活性。如果效果不理想，可以删除能引起自激活活性的诱饵蛋白的结构域，再用于酵母双杂交实验。

筛选培养基上的克隆太少。

可能的原因:酵母双杂交效率低，筛选条件太严格或者与目的蛋白相互作用的蛋白太少。

解决方法:延长杂交时间，提高杂交效率；放宽筛选条件；与目标蛋白相互作用的蛋白太少是诱饵蛋白本身的结构造成的，这是实验无法补偿的。

12酵母双杂交和酵母单杂交的文库可以共享吗？

对于核文库，酵母单杂交和酵母双杂交的文库是可以共享的，它们的构建方法是一样的，只是酵母单杂交的诱饵基因是核酸，通常是启动子序列，而酵母双杂交的诱饵基因是蛋白质。

生物技术可以提供以下技术服务

酵母文库构建和筛选文库

酵母单一杂质

酵母双杂

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