薄层色谱法的原理(薄层色谱分析法)

薄层色谱(Thin-layer chromatography)或薄层色谱(Thin-layer chromatography)是一种色谱分离技术，它利用涂在支撑板上的支撑物作为固定相，适当的溶剂作为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量。这是一种特别有效的色谱方法，用于快速分离脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱和其他物质。它从20世纪50年代开始发展，至今仍被广泛使用。

一.基本原则

薄层色谱是将支持物均匀地涂在支持板上(常用玻璃板、聚酯布等。)形成薄层，然后用相应的溶剂显影。薄层色谱可分为薄层吸附色谱(吸附剂)、薄层分配色谱(纤维素)、薄层离子交换色谱(离子交换剂)、薄层凝胶色谱(分子筛凝胶)等。根据固定相载体的不同。通常实验中广泛采用以吸附剂为固定相的薄层吸附色谱法。

吸附是表面的一个重要性质。任何两相都可以形成一个表面，吸附就是溶解在一个相中的物质或溶质在这个表面上的致密现象。吸附可能发生在固体和气体之间、固体和液体之间以及被吸附的液体和气体之间的表面上。

分子之所以能留在固体表面，是因为固体表面的分子(离子或原子)的引力不等于固体内部分子的引力。在固体中，分子间的相互作用力是对称的，它们的力场相互抵消。但固体表面分子受力是不对称的，向内一侧受固体内部分子影响，而表层受力较小。因此，当气体或溶质分子遇到运动中的固体表面时，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，吸附质在一定条件下可以脱附。单位时间内吸附在吸附剂一定表面积上的分子与同一单位时间内离开表面的分子之间可以建立一种动态平衡，称为吸附平衡。吸附过程是一个不断产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

比如硅胶和氧化铝作为支撑剂，主要原理是吸附力和分配系数的不同，这样混合物就可以分离。当溶剂沿吸附剂移动时，它与样品中的所有组分一起移动，同时发生连续的吸附和解吸以及重复的分配。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，吸附剂的吸附能力不同，混合物最终被分离成一系列斑点。如果将标准化合物一起展开在色谱薄板上，则可以根据这些已知化合物的Rf值(Rf值将在后面描述)来识别每个斑点的成分，并且可以进一步使用一些方法来进行定量。

薄层色谱法有许多优点:它保持了操作方便、设备简单、易于显色等特点。同时，开发速度快，一般只需15 ~ 20分钟；混合物易于分离，其分辨率一般比以前的纸色谱法高10 ~ 100倍。适用于仅0.01μg样品的分离，也可分离大于500mg的样品进行制备，还可使用浓硫酸、浓盐酸等腐蚀性显色剂。薄层色谱的缺点是生物大分子的分离效果不理想。

二、固定相支撑剂的选择和处理

在薄层色谱中，支撑剂的选择应主要考虑两个方面:一是支撑剂的性质和适用范围；第二是支撑剂的粒径。一般来说，选用的吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附容量，对不同的待分离物质应有不同的吸附容量，即足够的分辨率；所选吸附剂不会与溶剂和样品成分发生化学反应。吸附力的规律可以概括为:吸附力与两相界面张力的降低成正比，在物质溶液中的吸附程度与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂容易吸附极性物质，非极性吸附剂容易吸附非极性物质。同系物的吸附程度有一定的变化方向，比如同系物的极性降低，但非极性表面的吸附量会增加。

1、支持的性质和适用范围

硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺和DEAE-纤维素通常用作薄层色谱的支持剂。

(1)硅胶

硅胶是最广泛使用的极性吸附剂。其主要优点是化学惰性，吸附容量大，易于制备不同类型、孔径和表面积的多孔硅胶，一般用SiO 2·xH2O通式表示。硅胶的吸附活性取决于含水量。吸附色谱一般用含水量为10% ~ 12%的硅胶。当含水量小于1%时，吸附活性最高，而当含水量大于20%时，吸附活性最低。硅胶可以通过加热脱水活化，吸附活性降低的硅胶可以显著提高分离性能，增加上样量。
硅胶适用于分离酸性和中性物质，碱性物质可以与硅胶相互作用。所以如果用中性溶剂显影，碱性物质有时会留在原点，或者斑点拖尾，不能很好的分离。为了满意地分离某一类化合物，可以改变硅胶的酸碱性。例如，可以用一定pH值的稀酸或稀碱溶液(0.1 ~ 0.5 mol/L)或缓冲溶液代替水，配制一定pH值的酸性、碱性或薄层；也可以在硅胶中加入氧化铝(碱性)做成薄层；或者向显影剂中加入少量酸或碱来显影该层。

当使用硅胶和硅藻土时，通常需要在支撑板上涂布之前加入粘合剂。常用的粘合剂是煅烧石膏和淀粉。在硅胶、氧化铝、硅藻土中分别加入5% ~ 20%的石膏后，称之为硅胶G、氧化铝G、硅藻土G，以煅烧石膏为粘合剂的薄层容易从玻璃板上脱落，但具有抗腐蚀剂的优点。由淀粉制成的薄层具有良好的机械性能，但不适合使用腐蚀性试剂。

(2)氧化铝

氧化铝是一种弱碱性吸附剂，适用于亲脂性物质的分离和制备。氧化铝因其吸附容量高、价格低、分离效果好而被广泛应用。
使用氧化铝进行吸附色谱时，要注意选择活性和pH值合适的产品。一般来说，氧化铝根据制备方法的不同可以分为碱性、中性和酸性。碱性氧化铝可用于分离碳氢化合物；中性氧化铝适用于分离酸碱溶液中的醛类、酮类、醌类、某些苷类和不稳定的酯类、内酯类等化合物。酸性氧化铝适用于天然和合成酸性色素、醛和酸的分离。

(3)聚酰胺

聚酰胺是由己二酸和己二胺或己内酰胺聚合而成的。因为它们都含有大量的酰胺基团，所以统称为聚酰胺。

聚酰胺薄膜色谱法是1966年后发展起来的一种薄层色谱法。在分析氨基酸衍生物DNP氨基酸、甲状旁腺氨基酸、DNS氨基酸和DABTH氨基酸时，该方法具有灵敏度高、分辨率强、扩散快、操作简单等优点。目前用国产原料制成的聚酰胺薄膜性能良好，效果满意，已用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料等。磺胺类、抗生素、环酮类、农药、维生素b等16种化合物的分析。

(4)硅藻土和纤维素

它们是中性支持剂，吸收水、缓冲溶液或甲酰胺后只能用于薄层色谱。

2.支撑剂的粒径

用作薄层色谱固定相的载体颗粒应大小合适且均匀。如果粒径过大，溶剂的推进速度太快，分离效果不好；粒径太小，铺展太慢，点状拖尾不集中，分离效果差。当粒径固定在一定范围内，薄层厚度均匀时，每次得到的Rf值可以保持恒定。无机支撑剂粒径为150 ~ 200目(直径0.07 ~ 0.1毫米)，薄层厚度为0.25 ~ 1毫米，纤维素等有机吸附剂粒径为70 ~ 140目(直径0.1 ~ 0.2毫米)，薄层厚度为1 ~ 2毫米。

三。薄层制版
薄层制版简称制版，是指将其作为固定相的支撑剂均匀涂布在玻璃板上，形成薄层。所用的玻璃板要求表面光滑干净。玻璃板的尺寸根据需要选择，常用的规格有6cm×20cm、20cm×20cm、2.5cm×7.5cm

1.软板的制造

软板，也叫干板，是将支撑剂干粉直接均匀地铺在玻璃板上制成的，不需要粘合剂。这种薄层板制作容易，铺展快，但容易吹走。具体制作方法如下:

(1)选择一根直径约0.5cm的玻璃管，根据薄层厚度(一般0.4~1mm)，在两端缠绕胶带若干圈。

(2)将支架干粉倒在玻璃板上，固定住玻璃板的一端，防止玻璃前进时移动。

(3)将玻璃管压在玻璃板上，将支撑剂干粉从一端推向另一端，形成薄层。

2.硬纸板的制造

硬板或湿板是在支撑剂中加入粘合剂、水或其他液体，均匀地铺在玻璃板上，然后干燥而成的薄层板。该方法可采用专用薄层制版机或手工制作，可获得满意的结果。这里有三种手工涂布和制版的方法:

(1)玻璃棒涂层

将支撑剂与水或适当溶剂混合成胶浆，倒在玻璃板上，然后用玻璃棒将支撑剂在玻璃板上从一端推到另一端，与软板相同，即形成薄层。

(2)滑动涂层

将两块稍厚的玻璃板放在玻璃板的两侧，将支撑剂胶浆倒在中间的玻璃板上，然后用另一块载玻片的边缘将胶浆刮到另一端，即有一定厚度的薄层。干燥后，用小刀将片材两面的支撑剂刮掉。薄层的厚度可以通过改变玻璃板两侧不同厚度的载玻片来调节。

(3)倾斜涂层

将支撑剂胶浆倒在载玻片上，然后倾斜玻璃板，使胶浆均匀地涂在玻璃板上。

以上任何一种方法，在玻璃板上均匀涂上支撑剂后，静置一段时间。薄层表面无水渍后，放入烘箱，让温度升至100℃1小时。关闭电源，待温度降至接近室温时，取出薄层板，放入烘干机中备用。这一步称为激活。

第四，点样

进样是将处理后的样品加到薄层的特定部位，这是一个非常细致的操作步骤，进样的质量将直接影响分离效果。可以用玻璃毛细管取样。对于定量测定，应使用微量移液管或微量注射器。在处理和磨尖头部并校准体积后，使用商用血细胞计数器也是理想的。样品的位置一般用向上铺展法距薄层下端4 ~ 5 cm，向下铺展法距上端6 ~ 8 cm。对于两相纸色谱分离，斑点应位于离薄层右边缘5厘米和离底边5厘米的直线交点处。

薄层色谱取样法应注意以下几点:

(1)样品最好溶解在挥发性有机溶剂(如乙醇、氯仿等)中。)而不是水溶液。由于水分子与吸附剂的相互作用较弱，当其占据吸附剂表面的活性位置时，吸附剂的活性会降低，斑点会扩散。

(2)样品量不能太多，否则会降低Rf值，一般为几到几十μg，体积为1 ~ 20μ g。

(3)原点直径应控制在2mm以内。为了达到这个目的，需要分几次打印样品，并用冷热空气交替干燥。

(4)薄层板不宜在空气体中放置过久，否则会因吸湿而降低其活性。

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1.显影剂的选择

展开剂的选择取决于被分离物质的极性和支持剂的性质。主显色剂适用性的评价应根据其分离有效成分的效果来确定。如果没有，应调整极性，直到有效成分完全分离。

如果薄层色谱中使用的支撑剂是吸附剂，不同化合物在同一种吸附剂上的吸附性能有以下规律:①饱和烃不易被吸附；②不饱和烃容易被吸附，分子中双键越多，吸附越紧密；③当碳氢化合物被官能团取代时，吸附能力增加。通常，具有高吸附能力的化合物需要具有高极性的溶剂来促进它。

选择显影剂的另一个依据是溶剂的极性。一般来说，在同一种支撑剂上，溶剂的极性越大，相同性质的化合物的洗脱能力越大，即化合物在薄层上能被推得越远，Rf值越大。如果使用一种溶剂来展开某种成分，当发现其Rf值太小时，可以考虑改用极性更大的溶剂，或者在色谱的原溶剂中加入一定量的极性更大的溶剂。溶剂极性的顺序是:

石油醚

2.扩展层

铺地板装置有很多种，根据铺地板的方式，基本上可以分为上升式、下降式、连续式和卧式四种。没有粘合剂的薄层只能以近乎水平的方式向上或向下展开(板材与水平面的夹角为10-20度)。无论哪种展演模式，展演容器都必须是密闭的，显影剂蒸气必须提前饱和。容器的体积取决于薄板的面积，因为大容器比小容器需要更长的时间来达到溶剂蒸汽的饱和。根据实验，在非饱和展开装置中，由于混合展开剂中含有几种挥发性试剂，薄层板边缘与中间的试剂比例不同，因此样品边缘与中间展开层的距离也不同。这种现象称为边缘效应，严重时会影响分离效果。

为了在薄层色谱中获得更好的分离效果，可以采用双向铺展层和分数铺展层。先用一种溶剂将子铺展层铺展一定距离，然后取出薄层板，待溶剂挥发后，再用第二种溶剂同方向铺展。

第六，显色和量化

展开纸张后，将其从展开装置中取出，并在室温或烘箱中干燥。然后根据被分离物质的种类和性质，选择相应的显色剂进行喷雾显色，或者用紫外灯检测被分离物质的斑点，测量计算每个斑点的Rf值。薄层色谱分离的各种溶质组分在滤纸上的移动速度通常用Rf表示:

RF =组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=从原点到组分点中心的距离/从原点到溶剂前沿的距离。

当薄层、溶剂、温度等实验条件不变时，各物质的Rf值是恒定的，不随溶剂移动距离的变化而变化。与射频分配系数k的关系:

Rf=1/(1+αK)

α是由薄层的性质决定的常数。可以看出，K值越大，溶质在固定相中的分布趋势越大，Rf值越小。相反，k值越小，在流动相中的分布趋势越大，Rf值是定性分析的重要指标。

当样品中溶质较多或单相TLC中某些组分的Rf相近，难以明显分离时，可采用两相TLC。该方法是将滤纸在特殊的溶剂体系中向一个方向展开后，干燥，然后转向90度，在另一个溶剂体系中展开，待溶剂达到所需距离后，取出薄层，干燥，显色，从而得到两相色谱谱。用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分离，但在第二溶剂中可以用色谱法完全分离，分离效果大大提高。

由于薄层层析，定量分析时应注意以下几点:

(1)喷涂显色时，应小心操作无粘合剂的薄层，以免吹走吸附剂。

(2)薄层色谱法也可使用强腐蚀性的显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或其他混合溶液。这些显色剂可以将几乎所有的有机化合物转化为碳。如果支持剂是无机吸附剂，在薄层板上喷洒这种显色剂后，分离出的有机斑点将显示黑色。这种展开剂不适用于薄层定量测定或制备。

(3)如果样品斑点本身在紫外光下不显示荧光，可以采用荧光薄层检测法，即在吸附剂中加入荧光物质，或者在制备好的薄层上喷洒荧光物质，制成荧光薄层。这样在紫外光下，薄层本身显示荧光，而样点不显示荧光。吸附剂中加入的荧光物质一般为1.5%硅酸锌镉粉末，或在薄层上喷涂0.04%荧光素钠、0.5%硫酸奎宁溶液或1%磺基水杨酸丙酮溶液。

(4)由于薄层边缘的含水量不一致，薄层的厚度和溶剂的铺展距离都会影响Rf值。因此，在鉴定一定比例的样品时，应以已知的标准样品作为对照。

(5)当定量时，可以测量斑点的光密度，或者可以将一个斑点着色，将具有相同Rf值的另一个斑点与吸附剂一起从薄层板上刮下，然后可以用合适的溶剂将分离的物质从吸附剂上洗脱下来用于定量测定。

七。薄层色谱的现代发展

几十年来，薄层色谱因其诸多优点被广泛应用于混合物的分离、定性和定量分析，并逐渐取代了纸色谱分离技术。为了克服薄层色谱的一些缺点，获得更有效的分离效果，近年来在薄层制备、展开模式、分析鉴定手段和配套仪器设备等方面进行了许多创新，其中最根本的是对支持剂的改进。通过用更小直径的支撑剂颗粒代替常规支撑剂剂型制备的薄层具有比常规薄层更少样品、更快铺展速度、更短距离和更高分辨率的优点。而且这种新的薄层具有良好的光学特性，更有利于扫描分离斑点的光密度。为了区别于传统的薄层色谱法，这种新方法通常被称为高效薄层色谱法(HPTLC)，也称为现代薄层色谱法。

在高效薄层色谱中，为了保证固定的吸附活性和薄层板的相对湿度，可以用固定相浸渍剂处理预制板。处理后的薄层板一般不受外界湿度的影响。固定相浸渍剂可分为两类:①亲水性固定相多采用不同分子量的甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇或不同种类的盐溶液浸渍；②亲脂性固定相，一般用于反相色谱，多以液体石蜡、十一烷、十四烷、矿物油、硅油或油酸乙酯浸渍。它们中的一些可以通过与浸渍剂形成络合物或加合物来分离，例如用三硝基苯或苦味酸浸渍的那些。多环化合物可以通过络合反应分离。浸入NaHSO2中，可与羰基化合物形成加合物而被分离。