引物浓度(pcr扩增引物浓度)

1.没有Ct值(信号)出现。

1.反应循环次数不够:一般应该在35个循环以上，但超过45个循环会增加背景信号。

2.检测荧光信号的步骤存在误差:一般在72℃拉伸时采集荧光，而Taqman法一般在退火或拉伸结束时采集信号；

3.引物或探针的降解:其完整性可通过PAGE电泳检测；

4.探针设计不良:设计的探针温度低于引物温度，导致探针不能杂交，产物延伸；

5.模板量少:对于未知浓度的样品，应以系列稀释样品的最高浓度为起点；6.模板降解:避免样品制备中杂质的引入和模板的反复冻融。

二、如何确认模板中是否含有PCR反应有害物质？

有时逆转录和荧光PCR的RNA或cDNA模板中会有有害物质。为了确认有无这类有害物质，我们可以用高浓度的模板，用3-4个梯度稀释，用于荧光定量PCR反应。如果没有有害物质，Ct值会根据模板浓度而变化。但是如果模板中有有害物质，我们会发现高浓度的模板在实验过程中反应性能下降。第三，Ct值出现的太晚

1.反应条件差:为了达到最佳反应条件，可以重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等。

2.PCR的各种反应成分降解或加样不足；3.扩增产物片段过长:一般采用100-200 BP的扩增长度。

第四，标准曲线的线性不好。

1.样品加入有误差，标准样品稀释不梯度；2.标准品的降解:尽量避免标准品的反复冻融；3.劣质底漆或探针:重新设计；

4.模板中存在抑制剂，或模板浓度过高。5.阴性对照也表现出明显的扩增。

1.荧光PCR混合或水被污染；

2.引物二聚体的出现:35个周期后，阴性对照扩增是正常的，可根据溶出曲线分析；

3.反应过程中探针的降解:通过PAGE电泳检测探针；

不及物动词溶出曲线有多个主峰。

1.引物设计差:避免二聚体和发夹结构；

2.引物浓度差:适当调整引物浓度；

3.退火温度低:提高退火温度；

4.镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度；5.模板中的基因组污染:在RNA提取过程中避免基因组DNA污染，或者通过引物设计避免非特异性扩增。

七。荧光定量PCR中如何避免基因组DNA扩增？

1.避免引物设计过程中的基因组DNA扩增；

2.在RNA提取过程中，DNA酶ⅰⅰ用于去除RNA中的混合基因组DNA。

八、扩增效率低

1、降解反应试剂中的某些成分，尤其是荧光染料；

2.反应条件差:适当降低退火温度或改为三步扩增法；

3.反应体系中有抑制剂:一般是引入模板。模板应先适当稀释，然后加入体系以减少抑制剂的影响；

九。重复性差。

1.采样不准确；

2.仪器对样品的温度条件不同，温度均匀性不好；

3.模板浓度低:样品初始浓度越低，重复性越差，因此应降低样品的稀释倍数。

X.放大曲线不正常。一进入指数期，就迅速进入平台期，向右下方弯曲。

1.基线设置不当:按照仪器说明重新操作；

2.模板太多:当扩增曲线在10个循环内达到峰值时，模板在使用前应稀释100-1000倍。

XI。如何校正孔间荧光信号？由于加样操作误差、离心管透光性能差异、荧光激发效率差异等偶然误差不可避免，因此必须对仪器采集的原始信号进行归一化和校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中加入额外的荧光染料来实现，通常使用红色ROX荧光，这被称为阳性参考信号。反应缓冲液中ROX的浓度是固定的，因此其信号强度与反应体系的总体积和总荧光激发效率正相关。ROX校正可以提高定量数据的准确性和重现性，减少孔间差异。十二。模板不扩增后荧光定量PCR CT的一般值是多少？当对数期循环次数超过35次时，实时RT-PCR检测无效，基因不表达。当进入对数的循环数为32-35个循环时，至少需要重复3次才能判断是否能检测到基因表达。